基于微流体芯片的细胞操控关键技术研究

以细胞分离、筛选、捕获、定位培养等技术为代表的细胞操控技术在体外诊断、基础生物学等应用与研究领域具有广泛的需求和重要的价值。微流体技术对微小尺度上的流体及粒子、细胞等具有精确的操控能力,被广泛应用在多种细胞操控技术中。本论文以基于微流体芯片的细胞操控技术为研究对象,针对在生物医学应用和研究领域内有重要意义的细胞分离和定位培养等关键操控技术,分别开展了矩形直通道中的细胞惯性汇聚、混合注射方式的惯性微流体细胞分离技术、基于惯性汇聚的细胞定量分离与浓缩技术、结合捕获微井和蛋白质图案的细胞定位培养技术、以及用于人体循环肿瘤细胞检测的微流体芯片的研究,以期为生物医学研究和应用提供细胞操控方面的微流体工具与研究平台。

本文的主要工作和创新点如下:

(1)对细胞在低深宽比矩形直通道中的惯性汇聚原理和规律进行了研究,探究了粒子直径、流速对汇聚质量的影响,实现了粒子和Hep G2细胞在通道中的汇聚。在此基础上,针对利用低深宽比矩形通道从高浓度、多种类混合细胞样品中实现目标细胞分离的困难,以血液中循环肿瘤细胞的分离为目标,实现了一种采用混合注射方式的微流体细胞分离方法。该方法在利用惯性汇聚的同时,也利用了剪切致扩散效应及血液中的弹性力,实现了目标细胞在低深宽比矩形直通道中的汇聚以及与高浓度血细胞的分离。利用该方法,通过对血液稀释倍数、混合注射流速等因素的探索和优化,实现了从全血或低倍稀释血液中对目标粒子或细胞的分离。芯片从全血中分离直径18.7 μm粒子的效率达到了 82.5 ±10%,处理通量达到约5.6 ×108个/分钟;从2倍稀释的血液中分离粒子的效率达到94.1 ± 1.8%;从2倍稀释的血液中分离Hep G2细胞的效率达到了 90.8%±2.4%,处理通量达到约2.8×108个/分钟。该方法具备直接从全血或低倍稀释血液中分离目标细胞的能力,同时具有较高的处理通量,在诸如人体血液中循环肿瘤细胞的分离等应用中有一定的实用价值。

(2)针对广泛存的细胞定量浓缩需求,在惯性汇聚技术的基础上,通过定量调节出口通道的流阻比,实现了一种可对悬浮液中的细胞进行定量分离与浓缩的微流体芯片。利用荧光粒子,探究了出口系统流阻对粒子在通道中的运动轨迹及汇聚质量的影响,并通过对出口通道的流阻比的调节,实现了对悬浮液中粒子或细胞浓度的定量调节。该芯片能够对较广浓度范围内(10万个/毫升～180万个/毫升)的细胞悬浮液实现稳定的定量浓缩,对细胞的活性检测和后续培养结果表明细胞在浓缩过程中未受到可见的损伤。与传统的基于离心机的细胞浓缩方法相比,该方法在悬浮液质量、细胞丢失率、细胞损伤、处理时间、一致性、人员操作要求等方面均体现出一定的优势,为生物学和医学研究中广泛存在的细胞定量浓缩需求提供了一种高效便捷的微流体技术。

(3)结合细胞捕获微井和微接触转印技术,实现了一种单细胞水平上的、无需对细胞施加物理和化学束缚的图案化定位培养芯片。通过对微接触转印技术的工艺流程的优化,成功在封闭的微流体通道中集成了空间上相互对准的细胞捕获微井和蛋白质图案。利用捕获微井对细胞进行捕获,并在重力作用下将细胞释放到蛋白质图案上,实现了单细胞水平上的细胞捕获和图案化培养。分别使用HeLa细胞和SGC-996细胞在芯片内实现了长达6天的图案化定位培养,并对两种细胞在芯片内的贴壁、生长、迁移、增殖等过程进行了观察与研究。该微流体芯片摒弃了传统定位培养方法中存在的物理空间及化学成分上对细胞的束缚,提供了一种更为接近真实生长条件的、单细胞水平上的图案化细胞定位培养手段,在细胞迁移、神经网络培养、药物筛选、单细胞分析、细胞间作用等研究与应用领域具有一定的应用前景。

(4)实现了一种集成了细胞分离、捕获、培养和免疫染色表征技术的人体循环肿瘤细胞检测芯片。利用HeLa细胞优化了芯片在细胞捕获、培养及免疫荧光染色方面的过程。在此基础上,对肝癌患者外周血液中的循环肿瘤细胞实施了分离和捕获,并通过对CK、CD45两种特异性蛋白的免疫荧光染色表征,完成了循环肿瘤细胞的检测。该芯片无需对血液样本进行复杂的预处理、且具备较高的分离效果和处理通量,有望为人体循环肿瘤细胞检测提供一种高效、多功能的应用及研究平台。